在科研工作中，我们常常想通过PCR的方法确定未知样本中目标基因的绝对含量，如检测乙肝病人的每毫升血液中HBV DNA的精确拷贝数，这时我们就用到了实时荧光定量中的绝对定律分析。

绝对定量是用已知浓度的标准品绘制标准曲线来推算未知样品的量。将标准品稀释至不同浓度，作为模板进行PCR反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的CT值为纵坐标，绘制标准曲线，对未知样品进行定量时，根据未知样品的CT值，即可在标准曲线中得到样品的拷贝数。

1.绝对定量标准品的制备方法

将待测序列装入已知大小的质粒中作为标准品。ND-1000型微量紫外分光光度仪测质粒浓度，按以下公式计算质粒拷贝数：

质粒拷贝数( copies •μ L -1)=6.02 ×1023 ( copies • mol-1)×质粒浓度( g •μL-1) /质粒分子量( g • mol -1)

将质粒用ddH2O进行10倍倍比稀释，待测品与标准品加在同一块96孔板，使用与标准质粒相同的反应条件和相同的引物序列进行荧光定量PCR。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以CT值为纵坐标建立标准曲线。(X：Ct 值，Y：起始模板对数值)（见Fig.1）

2.倍比梯度稀释方法：

1v原液（标准品i）+9v稀释缓冲液，得标准品ii

1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii

1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv

1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v

依次倍比稀释

3.目的基因绝对值的计算

根据待测样本的CT值，即可在标准曲线中计算出荧光信号达到阈值时扩增产物的量，然后根据公式LogYCt=LogX+Ct×Log(1+E)计算原始模板的拷贝数。

X：原始模板的拷贝数；E：扩增效率；YCt：荧光信号达到阈值时扩增产物的量